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肿瘤相关RNA甲基化模范套路

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(篇幅较少,耐性读,一定受益不浅)

钻研目的与意义1974岁首年月次发现m6A甲基化,它是一种RNA分子上的甲基化修饰,m6A修饰正在哺乳动物细胞中是静态可逆的,类似于DNA和组蛋白修饰的另一种表观遗传调控,近年来,色久久好,色久久一个亚洲综合网,愉快五月丁香花综合网m6A甲基化已成为生命科学领域的钻研热点。经过历程诸多学者辛勤钻研,结果注解正在mRNA中发现的m6A修饰可以或许调理癌细胞的生命活动。其余我们知道EMT是上皮细胞获得间充质细胞特质的一种重要现象,经过历程EMT诱惑转录因子(歧SnailSlugTwistZeb)去遏止e-cadheri的表达增长癌细胞的转移,别的,Snaile-cadherin表达的重要转录因子,近年来盘绕EMT的表观遗传调控因素做了诸多钻研,发现DNA甲基化及组蛋白修饰等皆可加入肿瘤细胞EMT的发生发火发展,但mRNA修饰对肿瘤细胞EMT的影响还没有展示。

一、癌细胞中EMTmRNA的甲基化水平调控

 

以上统统这些数据注解用TGF-β措置责罚的癌细胞正在进行EMT进程。

为了证明m6A正在EMT进程中的作用,作者应用CRISPR / Cas9编辑系统,正在HeLa细胞中敲低METTL3,组成 METTL3Mut/− HeLa细胞。下图是METTL3正在野生型及METTL3Mut/− HeLa细胞中的卵白表达状态

进一步经过历程LC-MS/MS理会,结果展现,METTL3 Mut/− HeLa 细胞的m6A水平隐着低于野生型细胞,那也证实了METTL3作为mRNAm6A具有介导催化作用。

这些数据注解METTL3的缺失可以或许遏止癌细胞EMT的发生发火;

 

进一步经过历程蛋白质印迹理会展现ALKBH5的过表达增加了E-Cad同时降低了HeLa细胞中的MMP2FN

别的,正在METTL3Mut/−HeLaMett13敲低Huh7细胞中恢复了TGF-β诱惑的E-Cad下协调FN上调。 

凭证上述数据曾知道METTL3的缺失可以或许遏止癌细胞EMT的发生发火作者进一步钻研了METTL3的临床作用。TCGA数据展现,METTL3正在肝癌组织中的表达隐着高于癌旁组织

正在364名肝癌患者中,METTL3的表达与CDH1 mRNA呈背相关。这类联络干系与上述数据展现结果一致 

凭证Bertero等的报导,TGF-β可经过历程Smad2 / 3METTL3-METTL14- WTAP复合物之间的相互作用诱惑人胚胎干细胞(hESCs)中的mRNA甲基化。经过历程应用Smad2 / 3抑制剂B43154210μM)预处理HeLa细胞,然后用TGF-β进一步措置责罚3天,经过历程LC-MS/MS测定总mRNAm6A的比例,去谋略m6A正在mRNA上整体的甲基化程度。发现Smad2/3抑制剂SB431542SB)可以或许停滞TGF-β诱惑的HeLa细胞中m6A的上调。 

二、EMT的细胞,m6A会调控其余基因的改变

 

 

 

 

总的来说,m6A-seq数据展现m6A修饰发生发火正在EMT期间与细胞跟尾,粘附和迁移相关的少数基因上。

为了考据Sainl是加入m6A调理的癌细胞EMT的隐蔽靶点,作者经过历程正在EMT期间核定84EMT的相关基因和61 m6A调理基因(大于2m6A改变),究竟一定了四个堆叠基因。告别为SANI1CTGFMSNCTNNB1,正在四种核定的基因中,Snail被认为是把握EMT的重要转录因子。作者的数据证实Sainl mRNAm6A色久久好,色久久一个亚洲综合网,愉快五月丁香花综合网EMT期望期间正在CDS3'UTR区域中m6A的隐着富集,其余,作者经过历程RIP技术,发现在EMT细胞中,m6A水平的Sainl-mRNA显着增加,富集倍数与对照相比约为2.3倍。

 

 

接下来,作者钻研了正在HeLa细胞中敲低METTL3、和过表达ALKBH5Snail卵白的表达状态,。正在METTL3缺失和ALKBH5过表达的两种状态下,作者观察到HeLaHepG2细胞中Snail卵白水平的降低而ZEB1表达没有改变。

为了证实m6ASnail表达作用,作者用TGF-β措置责罚野生型和METTL3Mut /-HeLa细胞。结果展现,正在METTL3Mut /-HeLa细胞中,TGF-β诱惑的Snail表达低于对照细胞那注解m6A加入TGF-β诱惑的癌细胞中Snail的表达

 

 

四、m6A增长癌细胞中Snail mRNA的翻译

 

Act-D措置责罚野生型和METTL3Mut /-HeLa细胞以阻断转录。结果展现野生型细胞中pre-mRNAmat-mRNA的半衰期显着短于METTL3Mut /-HeLa 细胞。注解m6A修饰可以或许引发pre-mRNA的剪切和癌细胞中Snail mat-mRNA的降解

其余作者补充证实,SnailYTHDF2的靶标,其认真m6A介导的转录物mRNA去稳定化。过量表达YTHDF2可降低HeLa细胞中成熟Snail mRNA的表达和稳定性

别的,作者用MG132预处理METTL3Mut /-HeLa细胞以遏止卵白体外酶活性应用CHX阻断卵白翻译,然后用TGF-β措置责罚。结果数据展现,正在CHX而非MG132存不才, TGF-β诱惑的METTL3Mut /-HeLa细胞中的Snail表达减弱。

随后作者将Snail CDS跟尾到多克隆位点(MCS)构建了pmirGLO-Snail荧光素酶报告基因。 单荧光素酶测定展现,Snail正在METTL3Mut /-HeLa细胞中的翻译效率隐着低于野生型细胞。

 

上面作者对RNA住手分类,经过历程多散核糖体理会,发现METTL3Mut /-HeLa细胞中80S的核糖单体和多散核糖体皆低于野生型细胞。

注解正在EMT进程增长SNAI1 mRNA的转录翻译。

作者经过历程对m6A-RIP测序,数据展现CDS区域中m6A峰值位于第20条染色体上,48,600,490 to 48,600,630且正在3 'UTR

作者核定了3GGAC motif,告别位于CDS区域和Snail mRNA3'UTR区域;

上面作者对m6A甲基化对SNAI13'UTRCDS区域告别做了详细钻研。

那注解3'UTR上的m6A甲基化可以或许不加入m6A修饰调理的Snail表达;


数据展现,正在过量表达pcDNA-Snail-CDS-mut1METTL3Mut细胞中部分上调了Snail表达水平(上图)。将pcDNA-Snail-CDS-WTpcDNA-Snail CDS-mut1 / mut2转染的HeLa细胞住手TGF-β措置责罚。 卵白印迹结果展现,TGF-β诱惑的pcDNA Snail-CDS-mut1Snail表达低于pcDNA-Snail-CDS-WTpcDNA-Snail-CDS-mut2下图

总之,结果数据注解SNAI1 CDS区域中的m6A是表达调控的主要位置;

 

由于真核生物的翻译延伸是由两个延伸因子作用住手的,:eEF-1eEF-2,作者观察MetE13Mut -HeLa细胞中eEF-1eEF-2结合Snail mRNA的变异。数据展现,正在METTL3Mut-HeLa细胞中Snail mRNAeEF-2之间的结合隐着低于HeLa细胞中的结合。 别的,经过历程卵白定性分析注解,得到了类似的结果。 

六、m6A与癌细胞发展有关

那注解Snail加入了METTL3的体内转移作用。

 



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