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m6A第二弹正在背您袭来,发了19分!

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RNA甲基化是表观遗传学领域的钻研热点,也是高分文章的宠儿,如今大热点有m6A、m5C、m1A RNA甲基化,稀奇m6A修饰热度只删不减,那么,本期我们继续m6A。此次分享的文章是公布正在Nature Cell Biology上的“Stage-specific requirement for Mettl3-dependent m6A mRNA methylation during haematopoietic stem cell differentiation”,文章是关于造血干细胞(HSC)的钻研,也关于m6A,副角分子依旧是Mettl3卵白。

本文统统图片及数据均来源于:Lee, H., et al. "Stage-specific requirement for Mettl3-dependent m6A mRNA methylation during haematopoietic stem cell differentiation." Nature cell biology (2019).

 

钻研配景:造血干细胞(HSCs)连结平衡的自我更新和分化,但这些服从如何被正确调理尚不完全清楚。m6A mRNA甲基化已成为影响许多生物进程转录基因表达调控的重要情势。基于这些,作者睁开了执行。运用Lysm-cre转基因技术小鼠Mettl3条件敲除后,髓系细胞的数量和服从并未被影响HSCs分化受阻Myc的转录本是m6A最主要修饰靶基因HSC细胞住手MeRIP-seq,发现,Mettl3缺失的HSC细胞中,MYC的表达量着落,挽救执行中增加分化刺激因素也许人为上调表达MYC基因,皆可以或许使得挽救HSC的分化服从瑕玷。

钻研结果:

1、Mettl3卵白敲除后HSC细胞大量堆积

凭证已有钻研报导,HSCs可以或许直接发作血小板,经过历程腹膜注射pIpC到敲除Mettl青青草视频-青青草视频vip,青青草在线视频,99re2久久热青青草视频,青青草视频免费观看Mx1-cre中,经过历程齐血细胞计数理会展现Mx1-cre中血小板计数隐着降低;Mettl3fl/fl小鼠与pIpC措置责罚的对照相比,白细胞计数也显着降低且漫衍窜改,那注解m6A与造血服从相关;正在pIpC最后一次注射,10天时,Mettl3的缺失以致髓系细胞的数量显着减少,脾细胞无变化;注射后2-4个月,除髓系细胞的数量显着减少之外,脾脏大小及细胞构成反而增加;正在骨髓中,LSK和HSCs正在检测的时间点都有增加,且HSCs正在最后一次pIpC注射后10-14天到4个月一连增加,而LSK只是略有增加;其余,观察到Lin-Scal-cKit+CD150+CD41巨核细胞和CD41巨核细胞与对照相比显着增加。统统相关数据注解Mettl3的丧失以致HSC细胞堆积,并且影响巨核细胞谱系

 

2、Mettl3卵白缺失停滞HSCs一样平常分化

BrdU注射Mx1-cre鼠,检测细胞周期、细胞死亡等目的,结果发现:Mettl3fl/fl小鼠与对照相比,BrdU掺入并没有大的差异,但是细胞死亡显着增加;其余,应用5-氟尿嘧啶措置责罚pIpC注射的Mx1-cre小鼠时,Mettl3fl/fl小鼠的存活率低于对照组;那说明HSCs的蕴蓄可以或许是分化受阻而非自我更新增强。然后作者进一步运用甲基纤维素检测HSCs的分化才气,与对照相比,丧失Mettl3的HSCs组成集落更少且菌落更小,作者运用流式细胞术理会,发现这些细胞是不克不及分化的;但是,当Mettl3瑕玷的髓系细胞接种到甲基纤维素中时,与对照相比,组成的集落正在数量,大小和类型上相似,且这些菌落含有一样平常数量的分化细胞。那注解Mettl3的缺失以致HSCs的分化受阻,但正在体外限制性祖细胞中不存在此现象。

 

3、Mettl3是HSCs分化进程的必需分子

为了测试Mettl3的缺失是否是以致体内HSCs瑕玷,作者经过历程运用Mx1-cre500,000个髓细胞住手竞争性重组测定。 发现HSCs水平有降低趋势;作者将Mettl3瑕玷型和对照HSCs和野生型竞争性髓系细胞分选出来,并移植到致死量照射的小鼠中,移植对照HSCs的受体鼠能够大概重组主要造血谱系,但短少Mettl3的HSCs不克不及重组瑕玷主要发生发火正在骨髓和B谱系中,且短少Mettl3的HSCs正在自我更新上基本是一样平常的,但是随着分化层次推移,所分化的造血细胞逐渐减少;那注解Mettl3瑕玷型HSCs正在造血重组方面存在瑕玷,且Mettl3是HSCs分化进程的所必需的。

 

4、骨髓细胞生成不需要Mettl3

作者正在Lysm-cre中敲掉Mettl3卵白,6-8周龄的鼠各细胞参数一样平常(外周血、骨髓、脾细胞等参数),且皆可以或许组成一样平常外形的巨噬细胞;当遭到脂多糖进击时,展现出的炎性细胞因子Tnfa,Il1b和Il6均一般上调;Mettl3瑕玷型骨髓细胞也展现出凶猛的吞噬活性,这个现象与对照相似;那说明Mettl3不是成熟骨髓细胞连结服从所必需的,HSCs正在体内造血分化期间对Mettl3和m6A的阶段特异依托。

 

5、核定HSC中与m6A作用的靶基因

运用MeRIP-seq技术核定,发现在对照小鼠中,富集了2073个转录产物,而正在Mettl3瑕玷型HSCs的Mx1-cre中,经过pIpC措置责罚10天,只富集了995个转录产物,与对照相比,显着降低;那说明m6A修饰与Mettl3卵白的表达密切相关。别的,Myc, Junb 和 Tet2被认为是m6A修饰的主要靶基因,正在Mettl3瑕玷型HSCs中,这些基因的表达量也下调

 

6、Mettl3介导的m6A会窜改HSCs特性

作者正在Mettl3瑕玷型HSCs中找到384个上调基因,其中95个是m6A靶标,将基因分为m6A靶基因和非m6A靶基因,经过历程MeRIP-seq,发现m6A靶标相比,m6A靶标的转录物正在Mettl3瑕玷型HSC中具有轻微增加的丰度,凭证已有钻研报导,正在HSC中MYC卵白水平非常低正在经过历程转录机制住手分化后被上调MYC的缺失阻断HSCs分化,而更高水平的MYC卵白可以或许增长HSCs分化,这个现象与Mettl3瑕玷型HSCs的表型相似,因此,作者进一步经过历程MeRIP-seq技术检测,发现Mettl3瑕玷型HSCsMYC转录物水平没有显着改变,但是,GSEA基因富集理会结果发现Mettl3瑕玷型HSCsMyc-靶基因特性的隐着降低注解m6A可以或许主要调理Myc mRNA翻译,进一步正在MYC卵白中插入GFP卵白,用来检测MYC卵白表达量,结果:Mettl3的缺失以致HSCsMYC-GFP的表达隐着降低,正在激活HSCs分化后,对照HSCs的MYC-GFP表达上调,而Mettl3缺失型HSCs的MYC-GFP表达不克不及上调,那说明m6A是HSC中Myc mRNA翻译所必需的,特别是正在分化后。并且Myc自愿表达可以或许挽救由Mettl3缺失激发的HSCs分化瑕玷。

 

文章总结:运用Lysm-cre转基因技术小鼠Mettl3条件敲除后,髓系细胞的数量和服从并未被影响,但HSCs分化受阻;Myc的转录本是m6A最主要修饰靶基因HSC细胞住手MeRIP-seq,发现,Mettl3缺失的HSC细胞中,MYC的表达量着落,挽救执行中增加分化刺激因素也许人为上调表达MYC基因,皆可以或许使得挽救HSCs的分化服从瑕玷Mettl3所介导的m6A是HSCs分化进程中所必须的。

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